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PCR實驗室在操作時應注意事項

時間:2019-08-07

PCR(基因擴增實驗室)檢測微量感染因子時,操作人員容易因為污染而導致各種問題。SLD中檢實驗室技術根據多年行業經驗,給出的建議是:進行PCR操作時,操作人員一定要嚴格遵守一些操作規程,最大程度地降低可能出現的PCR污染事故的發生。?


一、PCR實驗室劃分操作區:?
    目前,對于普通PCR,業內還無法做到單人單管和實現完全封閉管理操作,但無論是否能夠達到單人單管,均要求實驗操作在三個不同的物理區域內進行,PCR的前處理和后處理一定要設計在不同的隔離區內進行:?
1、標本處理區,包括:擴增摸板制備;??
2、PCR擴增區,包括:反應液的配制和PCR基因擴增;??
3、產物分析區,包括:凝膠電泳分析,產物拍照及重組克隆制備。??
各工作區要具有一定的隔離,操作器材要專用,而且要有一定方向性,如,?標本制備→?PCR擴增→?產物分析→④產物處理。切記:產物分析區的產物及器材嚴禁拿到前后兩個工作區,避免交叉污染。?


二、PCR實驗室試劑分裝要求:?
    PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的負壓工作臺或超凈工作臺進行配制和分裝,所有的吸頭和加樣器都需固定放于其中,吸頭不能用來吸取擴增后的DNA和其它來源DNA:??
1、PCR用水應為高壓的雙蒸水;?
2、引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制;?
3、引物和d-NTP應分裝儲存,分裝時應標明分裝時間,以備發生污染時及時查找原因和追溯污染源頭;??

三、PCR擴增重要標準??
1、PCR實驗靈敏度?
    PCR實驗靈敏度:是指PCR擴增反應能夠檢測到目的基因的最小值。?研究結果表明,影響PCR擴增效率的因素,有模板的完整性、反應溫度、復雜程度、引物純度及其與模板結合效率、DNA聚合酶的熱穩定性與擴增性能、反應緩沖液的離子組成(主要指:陽離子)、反應優化劑等,這些因素都顯著影響
PCR實驗檢測靈敏度。在最佳擴增條件下,常規PCR反應能夠檢測到pg(10~12g)數量級目的基因。對于一個特定的目的基因,模板與引物通常都是已經限定好的因素。因此,選擇什么樣的PCR反應體系(包括DNA聚合酶與反應緩沖液等)就是研究者提高PCR實驗靈敏度的關鍵因素了。??
2、PCR實驗特異性???
    PCR實驗特異性:是指在PCR擴增過程中,專一性擴增目的片段而非其他
片段的性能。?
    在PCR實驗本身的靈敏度很高,且實驗條件未充分優化的情況下,通常會在目的片段出現同時伴隨有其它雜帶,即發生非特異性擴增現象。模板、引物性質及質量、反應條件控制等均會影響PCR擴增特異性。近年來的研究結果表明,緩沖液品質(如反應優化劑、離子種類與組成等)對保證PCR特異性擴增起著重要作用。??
3、PCR靈敏性和特異性關聯?
    PCR實驗靈敏度與特異性是一對此長彼消特性,這也決定我們實驗體系調節實際上就是需要找到適合實驗靈敏度與特異性的平衡點。由于PCR體系中的成分眾多,使得組合較多,篩選工作也就相對繁雜。?四、PCR實驗操作注意事項:?
    盡管PCR擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應導致的,但樣品間的交叉污染也是常見原因之一。因此,不僅要在進行擴增反應時要謹慎對待,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應謹慎操作,一般需做到以下幾點:?
1、戴一次性手套,若不小心濺上反應液,應立即更換手套;?
2、避免反應液飛濺,若不小心濺到手套或桌面上,應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;?
3、使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露于空氣中,避免空氣中氣溶膠的污染;?
4、操作多份樣品時,制備反應混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后再分裝,這樣既可以減少操作次數,避免污染,又可以增加反應的精確度;?
5、最后加入反應模板,加入后蓋緊反應管;?
6、操作時設立空白對照和陰陽性對照,既可驗證PCR反應的可靠性,又可
以協助判斷擴增系統的可信性;?
7、由于實際操作時加樣器很容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染,所以操作者最好使用高壓處理過的或可替換的加樣器。假如沒有這種特殊的加樣器,至少在PCR操作過程中加樣器應該專用,嚴禁交叉使用,尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個相鄰區域使用;?
8、重復實驗,驗證結果,慎下結論。?

五、綜述:?
    由于PCR實驗操作非常專業,在設計PCR基因擴增實驗室時設計師也要充分考慮上述技術要求,避免PCR實驗室在后續使用時出現返工、返修問題。



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